番玉米在我国农业生产中占有重要地位。玉米能否正常生产关系着我国粮食生产安全。随着商业化玉米杂交种的不断推广及玉米种子市场的不断扩大，一些种子生产及经营单位片面追求种子产量带来的收入而忽视了种子生产过程中质量环节的控制，造成低质量的种子流入市场，严重威胁了玉米生产，损害了广大农民的利益，对玉米育种行业也造成了冲击。因此，对玉米种子质量进行监测显得尤为重要。种子纯度是种子质量的重要指标之一(刘景云, 2011, 现代农业科技, 3: 103-104)。

生产上造成的种子混杂方式也多种多样，包括亲本自交种的混杂、其他品种的混杂及正交种、反交种的混杂等。传统品种纯度的检验方法主要依赖于品种的形态特征、生理特性及同工酶等指标。随着分子生物学的发展，分子标记技术越来越广泛的应用于品种纯度检测(李晓辉等, 2003; 张华生等, 2011)，国家和一些地方也相继出台了利用分子标记检测玉米品种纯度的方法。由于互交种基因组组成一致，现有的分子标记检测方法尚不能对互交种的混杂进行判定，也未见相关检测方法的研究报道。虽然从种子的形态学上能够对部分互交种进行分辨，但由于分子标记鉴定法具有不受环境影响及结果准确可靠等特点，因此发展分子标记鉴定方法是从根本上解决互交种判定的有效途径。

利用分子标记技术及相对定量原理对玉米互交种混杂进行检测的原理是：基于玉米互交种胚乳基因组等位基因的2倍剂量关系(假设亲本基因组某一位点等位基因基因型分别为AA和aa, 则互交种的胚乳基因型则为AAa和Aaa, 即互交种等位基因的剂量关系为分别A:a=2:1和a:A=2:1)，以互交种胚乳DNA为模板，在PCR反应进入指数扩增期时观察等位基因扩增量的相对变化。根据PCR反应的理论方程，此时等位基因扩增产物的相对量与初始模板相对量具有线性关系。同一PCR反应内等位基因相对定量在琼脂糖凝胶上表现为同一泳道共显性标记两条电泳条带的亮度关系。经过统计分析，即可对互交种混杂实现判定。

本研究利用分子标记技术及相对定量原理对玉米互交种混杂检测的可行性进行探讨，旨在建立一套成本低、操作便捷、适应性广、准确性高的互交种混杂检测方法，弥补现有的利用分子标记检测品种纯度的方法不能对玉米互交种混杂进行判定的空白。

1结果与分析
1.1 Insertion/Deletion (InDel)分子标记的开发与共显性标记的筛选
经过分析，B73、Mo17之间约11 400个长度小于100 bp的InDel位点(深度>3)可以进行标记开发。为了便于发展的标记进行琼脂糖凝胶检测，从中剔除了长度小于20 bp的InDel，选取部分长度大于20 bp的InDel位点进行标记开发。利用琼脂糖凝胶电泳对新发展的143对InDel标记进行评价，发现其中118对引物的PCR扩增产物与在B73、Mo17基因组中的预测大小相吻合，标记开发成功率达82.5%。根据B73基因组序列对新发展的标记进行分析，发现InDel长度差异多在20~80 bp之间，PCR产物长度在141~361 bp之间。通过InDel标记之间物理距离的分析，这些InDel广泛分布在玉米基因组的10条染色体上(图1)。从中随机选取8个B73、Mo17间特异扩增的共显性InDel标记(图2)，用于互交种BM及MB叶片基因组等位基因的扩增，验证标记在互交种叶片基因组等位基因的扩增质量(图3)。

图1 InDel标记在玉米染色体上的分布 Figure 1 Physical distribution of InDels in 10 chromosomes of Maize

图2 亲本间InDel 标记的筛选 Figure 2 The polymorphism amplified by InDel markers between Mo17 and B73

图3 共显性标记在互交种叶片基因组等位基因中的扩增 Figure 3 Amplification of co-dominant markers in the maize leaf DNA of direct and reciprocal crosses

标记在等位基因间的扩增质量由ImageJ图像软件生成的波形图判定，扩增质量高的引物的波形图应具有两个特征：(1)波形图曲线圆滑且波峰波谷明显，便于准确确定扩增主带区间；(2)互交种等位基因波形图一致，显示了标记在互交种等位基因间扩增的稳定性。图3中标记18的波峰波谷区分不明显，标记54的波形图出现了明显的锯齿状，曲线不够圆滑。因此，这两个标记会影响到定量的准确性。其余6个共显性标记扩增稳定，波形图符合定量要求，扩增产物长度介于117~301 bp之间，InDel大小介于43~143 bp之间(表1)，用于后续分析。

表1 共显性标记信息 Table 1 The information of co-dominant markers

1.2 PCR反应指数扩增期的确定
本研究以BM杂交种叶片DNA为模板，对相应标记不同PCR循环数的扩增产物量进行评价，确定不同标记对应的PCR反应指数扩增期。PCR循环数分别为27、29、31、33、35以及37个循环。结果发现，同一标记PCR产物的亮度随着循环数的增加逐渐加深，扩增条带也由模糊逐渐变为清晰，说明27~37个循环数的PCR反应处在指数扩增期(图4)。考虑到较强的电泳条带能够被ImageJ软件更准确地识别，因此，选择37个循环作为互交种鉴定的PCR反应循环数。

图4 共显性标记在不同PCR循环数下的琼脂糖凝胶电泳 Figure 4 The agarose gel electrophoresis amplification products from different PCR cycles

1.3互交种检测的统计分析
为了验证利用分子标记检测互交种混杂原理的可行性，将筛选出的6个共显性标记以确定的37个PCR循环数对5个正交种BM胚乳样本及5个反交种MB胚乳样本进行判定，每个样本3次重复。杂交种BM及MB叶片等位基因间扩增产物相对量的关系由同一批次6次重复间的平均值确定。为确保同一标记在杂交种叶片DNA及正、反交种胚乳DNA样本重复间扩增效率最大程度保持稳定，在PCR反应体系配制过程中采用统一混样然后分装的操作方法，各重复间PCR组分保持一致。

结果显示，标记在杂交种等位基因间扩增稳定，电泳条带清晰，ImageJ软件识别图像能够准确反映等位基因扩增相对量的关系(图5)。标记在等位基因间的扩增效率是否一致可由杂交种叶片DNA等位基因扩增产物相对量实测值与理论值1进行χ²测验确定(标记在等位基因间扩增效率越接近，杂交种叶片DNA中的等位基因扩增产物相对量实测值越接近1)。
统计分析发现，不同标记在等位基因间的扩增效率是不一致的(表2)。标记110在等位基因间的扩增效率近乎一致，杂交种叶片DNA等位基因扩增产物相对量实测值数值为1.003，χ²测验P为1.000，与理论值1差异不显著；标记81在等位基因间的扩增效率相差最大，杂交种叶片DNA等位基因扩增产物相对量实测值数值为3.603，χ²测验P为6.50E-08，与理论值1差异极显著。其它标记在等位基因间的扩增效率比介于标记110与8之间(标记83在胚乳DNA中的扩增条带强度不足以产生高质量的ImageJ波形图, 未列入分析)。

图5 标记81对互交种样本的鉴定 Figure 5 Identification of samples from direct and reciprocal crosses with marker 81

依据互交种的判定标准对互交种胚乳DNA等位基因扩增产物相对量实测值与理论值进行统计分析发现，标记13，40，43及81均能对互交种进行准确地判定，所有五个正交种胚乳样本等位基因扩增产物相对量实测值与正交种理论值无显著差异，与反交种理论值差异显著；所有5个反交种胚乳样本等位基因扩增产物相对量实测值与正交种理论值差异显著，与反交种理论值差异不显著(表2)。标记110能够对正交种进行准确判定，对反交种进行判定时发现等位基因扩增产物相对量实测值与正交种及反交种的理论值均无显著性差异。

表2 五个共显性InDel标记对互交种的鉴定 Table 2 The results of direct and reciprocal crosses with five co-dominant InDel markers

2讨论
2.1玉米互交种胚乳等位基因剂量关系
玉米杂交种是由两个不同的玉米自交系杂交得到的，正交与反交是相对的。一般的正、反交种的表现型没有差异，但是对于受细胞质基因控制的母性遗传性状，正交种与反交种会表现出显著差异。关于玉米母性遗传的研究目前已经涉及多个方面(Phillips and Evans 2011; Nodine and Bartel, 2012)。尽管受母本控制的部分性状可作为形态学标记对互交种进行鉴定，但是利用分子标记鉴定是从根本上实现互交种判定的可靠方法。现行的玉米品种纯度的分子标记检测标准不能对互交种的混杂进行区分，主要原因在于该检测标准是建立在不同玉米品种基因组成是有差异的基础之上的。由于互交种的基因均来自相同的亲本，因此，互交种含有相同的基因，基因组之间不存在质的差异。因此，如果从DNA水平上对互交种进行判定，只能从基因剂量的角度进行挖掘。玉米胚乳是一个精子和两个极核融合后发育形成的组织，基因组含有两个拷贝的母本基因及一个拷贝的父本基因，来自母本与父本的等位基因具有二倍剂量关系，可以此作为利用分子标记区分互交种的基础。

2.2关键技术环节控制
本研究利用互交种胚乳等位基因二倍剂量关系，通过分子标记相对定量结合统计学方法实现对玉米互交种的判定。因此，需要控制以下几个关键环节，否则读取的结果会受到影响。

(1)需要筛选亲本间特异扩增且具有清晰等位基因扩增条带的共显性标记。目前，利用分子标记技术进行农作物品种纯度检测主要使用的SSR (single sequence repeat)标记(Sundaram et al., 2008; Wu et al., 2010)。北京市质量技术监督局发布的玉米品种纯度及真实性SSR分子检测方法(DB11/T 507-2007)要求SSR标记的选择须遵守共显性、带型清晰、重复性好的原则，并未对分子标记在等位基因间的扩增效率提出要求。本研究利用杂交种叶片DNA (等位基因剂量关系为1:1)对共显性标记在等位基因间的扩增效率进行了分析，发现不同的标记在等位基因间的扩增效率表现不同，有的标记在等位基因间的扩增效率一致，标记在等位基因间扩增效率是否一致并不会直接影响对互交种的判定。

(2) PCR反应指数扩增期末期为最佳定量时期。PCR循环时期一般划分为三个阶段即初始反应期、指数扩增期及平台期。在PCR实际扩增中很难保证100%的扩增效率，非理想的PCR反应方程为X=X₀(1+EX)ⁿ。因此，在指数扩增期终产物的扩增量与初始模板量具有线性关系。在PCR反应体系配制过程中采用统一混样然后分装的办法保证各反应体系内的组分一致，确保同一标记在杂交种叶片DNA及互交种胚乳DNA中等位基因扩增效率稳定，即可利用等位基因扩增产物相对量进行统计分析。扩增条带强度越强，ImageJ得到的波形图越准确，因此，指数扩增期末期是进行相对定量的最佳时期。在实际操作过程中，需要做多个PCR循环数的比较，以便准确判定指数扩增期末期的循环数。

(3)相对定量只限于同一PCR反应内等位基因扩增的比较，即琼脂糖凝胶同一泳道的两条亲本条带间强度的比较，不可扩展为PCR反应间的比较。同一PCR反应内的初始模板等位基因剂量关系严格(互交种胚乳DNA中为2:1, 互交种叶片DNA中为1:1)，同一泳道亲本条带相对强度能够反映等位基因真实扩增相对量关系。

(4) InDel标记长度差异不可过大。等位基因扩增相对量是由琼脂糖凝胶电泳同一泳道两条亲本条带相对强度定量的。由于所用染料与扩增产物的结合效率一致，那么片段较长的扩增产物将结合更多的染料，亲本条带相对强度与等位基因扩增相对量会产生一定的偏差。因此，较小的InDel差异会大大降低偏差，使亲本条带相对强度最大程度的接近等位基因扩增相对量的真实值。

2.3 InDel标记
InDel标记作为一种有应用前景的遗传标记得到了研究者的关注(Bhattramakki et al., 2002)。尽管玉米品种纯度鉴定主要利用SSR分子标记，但InDel标记用于玉米品种纯度分析已有报道(张体付等, 2012)。目前，InDel较多用于基因组多态性的评价(冯芳君等, 2005; 申璐等, 2011)，未见用于互交种判定的研究。玉米基因组中存在大量的InDel多态，据估计每309 bp就有一个InDel (Vroh et al., 2006)，与植物基因组中每6.04 kb才出现一个SSR多态的频率相比(Linda et al., 2000)，InDel多态性更加丰富。随着玉米基因组测序及重测序工作的完成，玉米InDel多态性标记得到了更快的发展。多个研究发现在玉米的基因编码区及3'UTR端广泛存在InDel位点(Fu et al., 2006; Lai et al., 2010 )。这些位于基因编码区及调控区的InDel可能与基因的功能存在联系，更容易开发成功能性InDel标记。对于差异较大的InDel标记的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳即可分辨出长度差异。

本研究用于互交种鉴定的InDel标记扩增产物长度从117 bp到301 bp不等，InDel区段差异介于43~78 bp之间，利用琼脂糖凝胶很容易检测等位基因扩增片段的差异并实现相对定量，较之于SSR标记需要的聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法染胶过程，InDel标记的后续操作简单易行，成本较低。

2.4适应性分析
本研究选取的8个共显性InDel标记除3个不能满足分析的质量要求外，其余5个标记中的4个标记能够对互交种进行准确区分。标记110能够对正交种进行准确判定，但统计概率不能满足反交种界定的概率标准。送检样本进行纯度鉴定时都有明确的目的，若能确定送检样本只是互交种的混杂，则通过排除法也可利用110类型的标记对互交种进行鉴定。对于送检样品可能混有亲本自交种、其他杂交种的可利用现行的纯度检测标准将自交种及其他杂交种排除后再利用本方法区分互交种混杂。

随着InDel标记的逐步释放，可利用的InDel越来越多，本方法可大规模用于互交种的鉴定，无需受到自主开发InDel标记的技术限制。该方法所用的试剂、仪器等都是常规分子实验室所具备的，不需要特殊的操作及设备，检测成本低，操作简单，也适用于具有可用InDel标记的其它作物互交种的鉴定。

3材料与方法
3.1材料
供试材料为玉米自交系B73、Mo17、正交种B73×Mo17(BM)及反交种Mo17×B73(MB)。

3.2 DNA提取
B73、Mo17、BM、MB叶片DNA以及5个BM、5个MB胚乳样本DNA提取参照Karroten DNA提取试剂盒，DNA质量通过1%的琼脂糖凝胶检测。

3.3 PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳
PCR反应总为25 μL，包含2 mmol/L Mg²⁺，100 μmol/L dNTP，0.2 μmol/L引物，1 U Taq酶，100 μg DNA。PCR程序为：95℃ 3 min；95℃ 40 s，58℃ 40 s, 72℃ 40 s，37个循环；72℃ 5 min。扩增产物在2%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5 μg/ml)上以80 V电压电泳45 min，紫外透射仪上观察结果。

3.4电泳条带的定量分析
电泳条带的定量分析由ImageJ公共图像处理软件完成。将要分析的电泳图片进行校正后，利用软件的长型框工具选定要分析的区域，软件以波形图的形式显示选定区域的影像强度，突出的波峰对应的区域即为目标条带区，通过直线工具将波形图的目标条带区与非条带区分开，选择该软件的魔术棒工具点击目标波形区即可通过计算该区域面积得出电泳条带的强度。

3.5分子标记的开发与筛选
本研究所用的分子标记为自主开发的InDel标记。第二版B73全基因组序列从www.maizesequence.org网站上下载获得，Mo17二代序列分别来自中国农业大学和美国JGI-DOE。引物设计由emboss 软件包中eprimer3完成。开发的InDel标记在B73、Mo17间进行比较，筛选出扩增特异性强、扩增主带清晰的共显性标记。

3.6互交种胚乳等位基因相对定量原理
PCR反应方程为X=X₀(1+Ex)ⁿ。其中，n为扩增反应的循环次数；X为第n次循环后的扩增产物；X₀为初始模板量；Ex为扩增效率。当Ex=1时为理想的PCR扩增反应。在实际的操作中很难达到理想水平。假定玉米杂交种亲本中某一位点的一对等位基因分别为A、a，对于某一引物来说这对等位基因的PCR反应方程分别为X_A=X_A0(1+E_A)ⁿ、X_a=X_a0(1+E_a)ⁿ。其中，X_A、X_a分别为等位基因A、a第n次循环后的扩增产物量；X_A0、X_a0分别为等位基因A、a的初始模板量；EA、Ea分别为等位基因A、a扩增效率。在PCR指数扩增期阶段，等位基因扩增产物的相对量与初始模板量具有线性关系。由于杂交种叶片中等位基因A、a的初始模板相对量X_A0:X_a0=1，可由第n次循环后等位基因扩展产物相对量的实测值推测该引物在等位基因间的扩增效率的关系：(1+E_A)ⁿ/(1+E_a)ⁿ=X_A/X_a。若正交种胚乳基因型为AAa，反交种胚乳基因型为aaA，则正交种胚乳等位基因的剂量关系为A:a=2 (即胚乳初始模板相对量X_A0:X_a0=2)，反交种胚乳等位基因的剂量关系A:a=0.5 (即胚乳初始模板相对量X_A0:X_a0=0.5)。对于同一引物相同批次的以杂交种叶片DNA及胚乳DNA为模板的PCR反应，由于反应条件一致，杂交种叶片及胚乳基因组等位基因的扩增效率关系能够最大限度地保持稳定。因此，第n次循环后杂交种胚乳等位基因扩增产物相对量理论值与杂交种叶片等位基因扩增产物相对量的实测值即可建立如下关系：正交种等位基因扩增产物相对量理论值X_A'/X_a'=2 X_A/X_a (X_A/X_a为叶片等位基因扩增产物相对量实测值X_A/X_a同一批次样品重复间的平均值); 反交种等位基因扩增产物相对量理论值X_A'/X_a'=0.5/X_A/X_a。互交种等位基因扩增产物相对量理论值与其实测值进行统计分析，若理论值与实测值无显著性差异，则判定为正交种或反交种。

3.7统计分析
利用卡方(χ²)测验对互交种等位基因扩增产物相对量理论值与其实测值进行统计分析，计算概率P。若实测值与正交种等位基因扩增产物相对量理论值的统计P>0.05且与反交种等位基因扩增产物相对量理论值的统计P≤0.05，则判定为正交种，反之则为反交种。

作者贡献
葛敏负责分子标记的筛选及玉米互交种样本鉴定的部分实验操作；同等贡献作者蒋璐负责实验数据的整理及统计分析；张晓林参与了分子标记筛选及互交种样本鉴定的实验操作；赵涵最初提出了实验构想并完成分子标记的开发；通讯作者张体付在具体实验方案设计、论文写作及修改过程中起重要作用。

致谢
本研究由江苏省青年基金项目(BK2012375)和江苏省农业科技自主创新资金项目[CX(12)5020]共同资助。

参考文献
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